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elisa检测在BMG LABTECH的多模式酶标仪上进行德赢vwin官网客服

米里亚姆·厄皮尔,安东尼·希恩,罗恩·奥斯蒙德 TGR Biosciences Pty Ltd 03/2011
  • 埃莉莎一个™是一种来自TGR Biosciences的新技术,以测量荧光模式中的ELISA
  • 埃莉莎一个™检测EGF和TNFα的数据证明它既可靠又敏感和2。

介绍

埃莉莎一个TGR Biosciences开发了™技术,提供一种以用户友好的96孔格式运行高级夹层免疫测定的方法。埃莉莎一个测定使用传统的免疫三明治格式,但具有重要的差异。分析物和两种抗体加入到ELISA中一个测定微孔板同时,允许溶液相结合。在短暂的培养期后,洗脱未结合的测定试剂和分析物,并且仅检测含有两种抗体的免疫复合物。整个过程可以花费短短60分钟才能完成,并且只需要一个洗涤步骤。与其他ELISA格式相反,测定所需的目标特异性抗体不是预先结合的微孔板本身。抗体与分析物的结合在溶液中进行,允许有效结合。这不仅减少了测定时间,而且还为用户提供了几个其他好处。由于抗体未固定到板上,可以在同一微孔板上并排的不同孔中进行几种不同靶标的测定。另一个重要的益处是试剂寿命 - 许多ELISA套件需要在开放后一个月丢弃,主要是因为抗体涂层在开口后通常不稳定。用elisa.一个然而,昂贵的检测试剂是装在可重复使用的瓶子里,并且在ELISA后持续很长时间一个微型板块已经过期。廉价的微孔板可以简单地丢弃和另一个顺序,因为它们都是相同的。


埃莉莎一个TGR BioSciences公司开发的EGF、TNFα和IL-2检测方法被用于验证ELISA的稳健性和高灵敏度一个技术。


测定原则

埃莉莎一个™-协议概述

材料与方法

  • 人EGF,IL-2和TNFA都来自R&D系统
  • 埃莉莎一个™微孔板和测定试剂(抗体混合物,洗涤溶液和衬底混合物)来自TGR Biosciences
  • 基于过滤器的微孔板阅读器来自BMG LABTECH德赢vwin官网客服

方法:

埃莉莎一个由TGR Biosciences开发的EGF,TNFα和IL-2的™测定,用于展示ELISA的鲁棒性和高灵敏度一个技术。


简而言之,根据实验,含有10%FBS的BSA / PBS或RPMI中制备的分析物(50μL)分配到ELISA的二份孔中一个微型板块。在分析物后立即加入50 μL的抗体混合物,其中含有针对目标分析物的2种抗体。孔用平板密封,ELISA一个微孔板在室温下孵育1小时,温和振动。在此期间,抗体特异性结合分析物。从孔中吸出未结合的组分,用3×200μl的1×洗涤溶液手动洗涤孔。向孔中加入底物混合物(50μl),将微孔板用箔覆盖,并在室温下孵育10分钟,温和振动。揭示板,并测量荧光信号(EX 540nm和Em 590nm)。


对于恢复实验,井中的分析物的量由在同一板上的标准曲线计算,从10倍稀释的分析物的分析物中制备,从1000pg / ml为0.1pg / ml,对于EGF,10ng / ml对于IL-2和TNFA至0.1pg / ml。标准曲线适用于4个参数Sigmoider响应方程,配合方程用于估计每个实验中回收的分析物的量。

成绩与讨论

1.测定的重复性和灵敏度

在3个单独的实验中,对3种测定方法的重复性进行了评估。每一天,重组人EGF(图2A),重组人IL-2(图2B)或重组人TNFα(数据未显示)稀释到不同浓度的PBS中含有0.5%的BSA, 96孔ELISA一个测定板(n = 4孔/浓度点)。埃莉莎一个加入孔中,将测定孵育一小时,洗涤,并与ELISA孵育一个衬底混合10分钟。立即使用Polarstar Omega读取板多模标。检测限(LOD)近似使用仅用缓冲区控制+ 3x标准偏差获得的信号。

第1天 第2天 第3天
lod(egf) 0.1 pg / ml 0.4 pg / mL 0.4 pg / mL
LOD (- 2) 1 pg / mL 4 pg / mL 1 pg / mL
LOD(TNFA) 4 pg / mL 1 pg / mL 1 pg / mL

2.从组织培养上清中回收分析物

研究了从组织培养基中回收已知量分析物的测定能力。

每天,重组人ENGF(图3A),重组人IL-2(未示出的数据)或重组人TNFα(图3B)稀释至表示大于3-对数范围的浓度(20pg / ml,在96孔ELISA中含有10%FBS的RPMI中100pg / ml,500pg / ml或2500 pg / ml)一个测定板(n = 2孔/浓度点)。埃莉莎一个向孔中加入抗体混合物,将测定孵育1小时,洗涤,并与ELISA温育一个基板混合10分钟。立即读取底片。该方法能够准确地回收3-log范围内的不同浓度的分析物。


回收率采用分析专用标准曲线测定,用含10% FBS的PBS稀释,并拟合为非线性的4参数s型曲线。使用与所有BMG LABTECH微孔板阅读器接口的MARS评估软件,这些计算可以很容易地进行。德赢vwin官网客服

结论

本应用说明建立了ELISA试剂盒一个™(TGR Biosciences:www.tgrbio.com.)作为检测生物样品中的生物标志物的鲁棒和敏感的技术。与传统的ELISA测定相比,其易于实施和基本上减少的制备时间代表了ELISA技术的实质性进展。BMG Labtech的基于滤光片的微孔板读卡器提供了一种易于使用的仪器,可以快德赢vwin官网客服速,准确且稳健地测量基于荧光的测定。

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