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荧光探针NR12S检测血浆膜胆固醇水平的变化

温迪S.史密斯Sopsamorn U. Flavell大卫J. Flavell 南安普顿总医院西蒙·弗拉维尔白血病研究实验室 02/2017
  • NR12S Fl荧光膜探针可用于半量化活细胞血浆膜中的胆固醇水平

表的内容

介绍

胆固醇在真核细胞的细胞膜组织和功能中起着重要的作用,它在细胞膜中分布不同,但富集于质膜(PM)。1。存在几种用于测量细胞中胆固醇的总量的方法,例如酶偶联的Amplex®红色的胆固醇测定。这里我们描述了一种使用亲脂荧光探针NR12S来研究质膜胆固醇水平变化的方法2在BMG LA德赢vwin官网客服BTECH的微孔板读卡器上®欧米茄。我们通过使用治疗的组合耗尽了胆固醇的细胞来说明了NR12S-测定的EFICY:与甲基-β-环糊精(MßCD)孵育并在含有Lovastatin的嵌合培养基中孵育。甲基-β-环糊精(MßCD)已广泛用于从细胞血浆膜中除去胆固醇3.而洛伐他汀是胆固醇生物合成的抑制剂4.


测定原理

NR12S是一种基于尼罗红的化合物,可作为荧光膜探针来测量细胞膜脂质序的变化。化合物的荧光发射光谱随着脂质序的变化而变化,当与无序液相相相比,被纳入有序液相(增加的胆固醇)相时,荧光发射光谱向更短的波长移动5.。两性离子头组和长烷基链是指该化合物选择性地染色模型和细胞PM的外部lea fl等2。NR12S探针的发射比(FIR560nm/630nm)随胆固醇的变化而变化2


材料与方法

  • 96井在底部的黑色板(Greiner)
  • Fluostarω麦铂读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服
  • NR12S(博士博士,UniversitiédeStrasbourg)
  • RPMI 1640(无酚红,R7509) (Sigma Aldrich)

未经处理的或脂质耗尽的人类血液学细胞系(Daudi,Ramos和HSB-2)(6×106.每次处理)在RPMI中洗涤两次并在2×10处重新悬挂6.细胞/ ml。与对照细胞相比,在脂质剥夺的细胞中预期降低血浆膜胆固醇。对于染色,在在使用前使用之前稀释的0.04μMNR12S的等体积,将在室温下在黑暗中温育7分钟。然后将细胞在RPMI中洗涤两次,并在600μlRPMI中重新悬浮。将等分试样(100μl)加入到96孔黑色板中,并测量流雾浓度。

仪器的设置

测量类型: 荧光强度(上)
闪光/: 10.
阅读模式: 终点
多种多数
激发波长: 520海里
发射波长1: 560nm.
发射波长2: 630海里
获得: 2800
定位延迟: 0.2秒

结果与讨论

甲基-ß-cyclodextrin (MẞCD)用于去除三种不同细胞系PM中的胆固醇。图2显示,细胞暴露于浓度增加的MẞCD 1h后,NR12S荧光强度比(560 nm/630 nm)下降,表明PM胆固醇含量下降。

在确定去除PM中的胆固醇降低了560 nm/630 nm荧光强度比后,我们研究了不同处理对道迪细胞膜胆固醇水平的影响。条件优化,以消耗细胞的胆固醇,同时保持其活力和增殖能力。

在用10%FCS(R10)或用Lovastatin的较多的培养基(DR10)中培养培养物之前,将细胞与1mMmßCD或培养基一起温育1H。图3A显示用MßCD处理的细胞减少10%,随后在10%FCS中保持在全培养基中。用MßCD处理和洛伐他汀孵育减少血浆膜胆固醇30%。

使用电喷雾电离(ESI)质谱(MS)测定的总细胞胆固醇水平在很大程度上同意使用NR12S测定来测量PM胆固醇的结果。最初用MβCd处理的Daudi细胞并在DR10中生长在具有洛伐他汀的DR10中含有较少的胆固醇,而不是仅暴露于含有洛伐他汀的DR10。ESI MS测量的胆固醇水平显示出较大的减少,因为测量了总细胞胆固醇。


图4显示了在2小时、6小时和24小时后将脂质缺乏的细胞恢复到完全培养基的效果。6小时后,脂质剥夺细胞的质膜胆固醇明显升高,而在完全培养基中再过18小时,这一变化不明显。

结论

荧光NR12S探针间接监测活细胞的血浆膜胆固醇水平的变化,从而在ESI-MS获得的数据上扩展,这允许在细胞裂解物中定量总胆固醇。FLOSTAR OMEGA的FOL的FOR荧光测量的敏感性可确保可靠地检测两个发射波长的胆固醇引起的变化,并且还通过使用MARS分析软件的加速比计算来支持。德赢Vwin安全吗


参考文献

1. Ikonen,E。(2008)NAT Rev Mol Cell Biol 9:125-138
2. Kucherak,O. A.等人。(2010)J AM Chem SoC 132:4907-4916
3.Zidovetzki, R.,等(2007)生物物理学报,1768:1311-1324
4.托伯特(2003)《现代药物研究》第2期:517-526
5.Darwich, Z.,等(2012)生物化学与生物物理学报1818:3048-3054

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