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荧光探针NR12S检测血浆膜胆固醇水平的变化

Wendy S. Smith Sopsamorn U.Flavell David J.Flavell Simon Flavell Leukemia Research实验室,南安普敦南安普敦综合医院 02/2017
  • NR12S Fl荧光膜探针可用于半量化活细胞血浆膜中的胆固醇水平

介绍

胆固醇在真核细胞膜组织和功能中起重要作用,而在细胞膜之间可变地分布它在血浆膜(PM)中富集1。存在几种用于测量细胞中胆固醇的总量的方法,例如酶偶联的Amplex®红胆固醇测定。在这里,我们描述了使用亲脂性荧光探针NR12研究血浆膜胆固醇水平的变化的方法2在BMG La德赢vwin官网客服btech微孔板读卡器Flyostar®欧米茄。我们通过使用治疗的组合耗尽了胆固醇的细胞来说明了NR12S-测定的EFICY:与甲基-β-环糊精(MßCD)孵育并在含有Lovastatin的嵌合培养基中孵育。甲基-β-环糊精(MßCD)已广泛用于从细胞血浆膜中除去胆固醇3.洛伐他汀是胆固醇生物合成的抑制剂4.


测定原则

NR12S是一种基于尼罗的基化合物,可用作荧光膜探针,以测量细胞膜膜中的脂质顺序变化。化合物的流动发射光谱响应于脂质顺序而变化,当与液体无序相比掺入液体有序(增加胆固醇)相的液体时朝更短的波长移位5.。两性离子头组和长烷基链是指该化合物选择性地染色模型和细胞PM的外部lea fl等2。NR12S探针随着胆固醇的函数而改变其排放比(FIR560nm / 630nm)2


材料与方法

  • 96井在底部的黑色板(Greiner)
  • Fluostarω麦铂读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服
  • NR12S(博士博士,UniversitiédeStrasbourg)
  • RPMI 1640(酚红,R7509)(Sigma Aldrich)

未经处理的或脂质耗尽的人类血液学细胞系(Daudi,Ramos和HSB-2)(6×106.每次处理)在RPMI中洗涤两次并在2×10处重新悬挂6.细胞/ ml。与对照细胞相比,在脂质剥夺的细胞中预期降低血浆膜胆固醇。对于染色,在在使用前使用之前稀释的0.04μMNR12S的等体积,将在室温下在黑暗中温育7分钟。然后将细胞在RPMI中洗涤两次,并在600μlRPMI中重新悬浮。将等分试样(100μl)加入到96孔黑色板中,并测量流雾浓度。

仪器设置

测量类型: 荧光强度(顶部)
每井闪烁: 10.
阅读模式: 终点
多种多数
激发波长: 520nm.
发射波长1: 560nm.
发射波长2: 630nm.
获得: 2800
定位延迟: 0.2秒

成绩与讨论

甲基-β-环糊精(MßCD)用于从3个不同细胞系的PM中除去胆固醇。图2显示细胞暴露于增加浓度的MßCd浓度1H,导致NR12S流荧光强度比560nm / 630nm的降低表明PM胆固醇量的减少。

已经确定从PM中除去胆固醇降低了560nm / 630nm流荧光强度比我们研究了不同治疗对Daudi细胞膜胆固醇水平的影响。优化条件以耗尽胆固醇的细胞,同时保持其活力和增殖能力。

在用10%FCS(R10)或用Lovastatin的较多的培养基(DR10)中培养培养物之前,将细胞与1mMmßCD或培养基一起温育1H。图3A显示用MßCD处理的细胞减少10%,随后在10%FCS中保持在全培养基中。用MßCD处理和洛伐他汀孵育减少血浆膜胆固醇30%。

使用电喷雾电离(ESI)质谱(MS)测定的总细胞胆固醇水平在很大程度上同意使用NR12S测定来测量PM胆固醇的结果。最初用MβCd处理的Daudi细胞并在DR10中生长在具有洛伐他汀的DR10中含有较少的胆固醇,而不是仅暴露于含有洛伐他汀的DR10。ESI MS测量的胆固醇水平显示出较大的减少,因为测量了总细胞胆固醇。


图4显示了在两次,六二到二十四小时后返回脂质剥夺的细胞对全介质的影响。在6H之后,脂质剥夺细胞的血浆膜胆固醇的含量明显增加,并且在全培养基中另外18小时后,这并未显着。

结论

荧光NR12S探针间接监测活细胞的血浆膜胆固醇水平的变化,从而在ESI-MS获得的数据上扩展,这允许在细胞裂解物中定量总胆固醇。FLOSTAR OMEGA的FOL的FOR荧光测量的敏感性可确保可靠地检测两个发射波长的胆固醇引起的变化,并且还通过使用MARS分析软件的加速比计算来支持。德赢Vwin安全吗


参考

1. Ikonen,E。(2008)NAT Rev Mol Cell Biol 9:125-138
2. Kucherak,O. A.等人。(2010)J AM Chem SoC 132:4907-4916
3. Zidovetzki,R.等人(2007)Biochimica et Biophysica Acta 1768:1311-1324
4. Tobert,J.A.(2003)NAT Rev Disp Discov 2:517-526
5. Darwich,Z.,et al(2012)Biochimica et Biophysica Acta 1818:3048-3054

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