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在欧米茄上的OxiSelect细胞抗氧化试验(CAA)

Hanaa Yamani (1) Giovanni Abbenante (2) (1)墨尔本皇家墨尔本理工大学德赢vwin官网客服 05/2015
  • 叶和油提取物的测定
  • 植物类黄酮槲皮素为标准物质
  • 火星数据分析软件为整个数据处理提供一键式功能

表的内容

介绍

当我们进食或呼吸时,体内的活性氧(ROS)作为正常代谢过程的一部分而产生。体内ROS异常水平的积累与多种疾病有关,包括糖尿病、肾缺血、动脉粥样硬化、癌症和一般的衰老。


有一种可能性是,食用含有高水平抗氧化剂的食物可以实质性地促进个人的健康和幸福。为了支持这一理论,有必要量化食品的德赢Vwin安全吗抗氧化潜力。


为此,近年来开发了一套检测方法在体外食物的抗氧化分析。这些包括诸如;TEAC, FRAP, TRAP, Folin, DPPH, CUPRAC和ORAC。1虽然这些检测方法可以定量测定未加工食品和加工食品中抗氧化剂的含量,但它们不能提供抗氧化剂摄入时的生物利用度的任何信息。


为了部分解决这一局限性,Wolfe和Liu首次开发了一种利用人肝癌细胞(HEPG2)细胞的细胞抗氧化试验(CAA)。2最近,该试验也适用于许多不同的细胞系。3.此外,一种细胞抗氧化检测试剂盒(OxiSelect)现在已经上市。本应用笔记显示了用OxiSelect试剂盒检测一种匿名植物精油和叶提取物的结果。


测定原理

该实验依赖于活细胞的能力,使非荧光酯化染料前体2 ',7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)通过细胞膜扩散。一旦进入细胞,染料被细胞的酯酶去酯化为2 ',7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH),并被困在细胞内。细胞被清洗,在加入自由基引发剂(AAPH)后,非荧光染料(DCFH)被转化为高荧光的2 ',7 ' -二氯氯酚荧光素(DCF)(图1)。


当含有染料的细胞也与抗氧化剂孵育时,可或多或少地防止自由基诱导的DCF反应。为了量化的能力,一种抗氧化剂,防止自由基诱导反应的活细胞荧光的标准曲线和时间与不同数量的标准(槲皮素,一个强大的抗氧化剂)首先构造和各种食物的能力提取物抑制自由基诱导的反应相比,这个标准。


材料与方法

  • OxiSelectTMCell Biolabs公司的细胞抗氧化活性测定试剂盒(#STA-349)
  • FLUOstar®Omega multidetection microplate reader from 德赢vwin官网客服BMG LABTECH

试剂盒包含96孔组织培养处理的透明底黑色微孔板、DCFH-DA染料、自由基引发剂(AAPH)以及槲皮素标准品。


槲皮素标准曲线
按照测定手册的规定制备槲皮素标准品,2.8%自由基引发剂溶液,2倍稀释DCFH-DA原液。


样品制备
精油原液浓度为20µl/ml细胞培养液,配制4种稀释浓度:10µl/ml、5µl/ml、2.5µl/ml、1.25µl/ml。以20mg /ml细胞培养液配制叶提取物原液,分别配制10mg /ml、5mg /ml、2.5 mg/ml和1.25 mg/ml溶液。


HepG2细胞的浓度为6 × 104细胞在100µl每孔生长培养基中培养24小时,直到细胞90%至100%融合。微孔板外孔为空。播种后,取出培养基,用PBS/HBSS轻轻洗涤细胞3次。所有孔分别用稀释2倍的DCFH-DA探针溶液(50µl)和槲皮素标准品或制备样品(50µl)处理。37℃孵育60min。然后用PBS/HBSS洗涤细胞3次,最后洗净并丢弃。最后,将100µl的自由基引发剂溶液用车载喷射器注入所有的井中,在37°C的条件下,在flustar Omega上读取板1小时,每1-5分钟收集数据。对照品不含标准品或样品。空白仅由未加入自由基引发剂的细胞组成。

欧米茄仪器设置

测量方法: 荧光强度
阅读模式: 平板模式,顶部读数
定位延迟: 0.5秒
过滤器: Ex 485nm, Em 520nm
不。每口井闪光次数: 20.
不。周期: 12
周期时间: 300年代
温度: 37°C

结果与讨论

在只包含带有染料前标的细胞的控制孔中,AAPH的添加导致荧光随时间的强烈增加(图2)。

不含自由基引发剂的空白,随着时间的推移只显示出非常小的荧光增加,这是由细胞中已经存在的ROS引起的。槲皮素标准可防止染料被氧化。预防的程度取决于抗氧化剂的浓度和它穿过细胞膜的能力,以及它在活细胞内许多酶的代谢和降解过程中幸存下来的能力。


从信号曲线下的面积(AUC)是确定使用' SUM '函数在火星数据分析软件。然后从所有井中减去空白井的AUC。CAA值由软件根据公式计算:


CAA = 100 - (AUC(样本)/AUC(对照)*100)。


利用槲皮素标准品的CAA值,建立一个4参数的标准曲线(图3)。

为了确定样品的定量宽松值,选择在槲皮素标准曲线的浓度范围内的抗氧化剂。稀释系数是软件考虑的。所得值为:每毫升油中含有µ摩尔槲皮素(槲皮素当量,QE),每克叶提取物中含有槲皮素当量。


更严格的计算方法是求EC50每一种抗氧化剂在平板上使用的值,并将它们进行比较。该方法由沃尔夫详细描述。2该方法确定的定量宽松值考虑了所有的浓度被测量,同时。两种方法得到的QE值比较见表1。从结果可以看出,叶提取物的抗氧化潜能是同一植物精油的两倍。


表1:精油和叶提取物样品中的槲皮素当量(QE)。

量化宽松政策的价值 4-parameter适合 平均效应图
精油 23.2µ摩尔QE /毫升 19.0µ摩尔QE /毫升
叶提取 40.7µ摩尔QE / g 38.1µ摩尔QE / g

结论

与MARS数据分析软件一起,fluisstar Omega微孔板阅读器可以很容易地通过OxiSelect细胞抗氧化试验来测量食物或食物提取物的细胞抗氧化潜能。


参考文献

1.Lopez-Alarcon C., Denicola A.(2013)。肛交。詹。学报,763,1 - 10。
2.刘仁华(2007)。j·阿格利司。食品化学。, 55岁,8896 - 8907
3.Blasa M., Angelino D., Gennari L., Ninfali P.(2011)。食品化学,125,685-691。

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