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使用ATP生物发光测定来量化细胞细胞毒性

Bernd Hipler 德赢vwin官网客服 05/2007
  • 荧光素酶/荧光素反应用于测量细胞中ATP的量
  • ATP生物发光测定提供高灵敏度和宽动态范围

表的内容

介绍

文化中可行细胞的定量是一个非常重要的问题。然而,当在进行生长调节物质和细胞毒性药物的效果时,该技术变得更有价值。培养中活细胞数的测量是各种生长因子的功能性体外生物测定中的关键方面。核苷酸腺苷三磷酸(ATP)在生物系统中的能量交换中起着重要作用。它用作能量的主要立即供体,并存在于所有代谢活性细胞中。ATP已被用作活细胞功能完整性的工具,因为所有细胞都需要ATP保持活力并进行其专业功能。大多数ATP在活细胞内发现并链接分解代谢和合成代谢过程。细胞损伤或氧气/底物耗竭导致细胞质ATP的快速降低。因此,ATP的测量是对生物过程研究的基础。许多方法已被用于ATP测定,但远远来看,最成功的技术是生物发光方法,因为它的灵敏度和宽动态范围。 ATP bioluminescence has been used for determining levels of ATP in a number of different cell types.

测定原理

通过从萤火虫(Photinus Pyralis)获得的酶荧光素酶催化反应。mgatp.2-根据以下等式将Luciferin转化为能够在高量子产率化学反应中被荧光素酶催化氧化的形式:

在最佳条件下,光强与ATP浓度呈线性关系。用合适的洗涤剂直接裂解细胞可以测量细胞ATP,释放的ATP然后自由地与荧光素-荧光素酶反应,导致在562 nm处发光。


在该研究中,ATP生物发光用于确定培养物中存在的HACAT细胞数是否存在线性关系和测量的发光。试图根据两种不同的物质使用ATP-生物发作作为增殖和/或细胞毒性的量度,并避免使用无线电同位素。使用角蛋白酶细胞系HaCAT进行了这些研究。

材料与方法

试剂和仪器
Hacat细胞,在75平方CM组织培养中繁殖,在DMEM(血清型,FG 0435,Biochrom Kg,德国)的每周通道含有10%胎牛血清和1%抗生素/抗催乳剂溶液,在37℃和6%CO2。将细胞以5000个细胞的密度接种在微量滴积压板(Greiner 96孔板)中。


在无血清培养基(Gibco- Defined keratincell -SFM)中,在添加透明质酸的SFM中,加入透明质酸或培养基24小时或48小时后,检测细胞增殖情况。

ATP生物发光
ATP释放剂(严重化),Tris-醋酸盐缓冲剂,ATP监测试剂(萤火虫荧光素酶,D-Luciferin)和ATP标准(例如+ G. Wallac,Turku,Finland)需要进行。


将含100µL HaCaT细胞的96孔微滴培养板(德国Greiner),每孔加入ATP释放剂100µL,室温孵育5分钟。然后将180µL的细胞裂解液加入96孔白色不透明的微量滴定板孔中。


该板装入BMG Labtech德赢vwin官网客服标仪20µL荧光素-荧光素酶试剂(用10 mL 0.01重组。用M - Tris-acetate缓冲液,2 nM EDTA缓冲液,ph为7.75)注射泵入各孔,测定样品。


添加荧光素-荧光素酶后,在10 s的时间内监测荧光(快速动力学方法)。光输出以积分相对光单位(RLUs)表示。ATP测量在室温下进行。

结果与讨论

通过ATP生物发光测定细胞数和细胞增殖/细胞毒性的程度,与常规方法相比,染料Hoechst 33342的染色。


最初使用HaCaT细胞来确定细胞数量与测量的ATP之间是否存在相关性。多组实验测定ATP标准曲线(图1)(r = 0.998;p < 0.0001)。从图2可以看出,用ATP释放剂(100µL)在室温下孵育5 min后,释放的ATP增加(r = 0.99;p< 0.0001)。

通过比较每个数据点的细胞数量和atp -生物发光读数来确定相关性,并确定整个组的Spearman等级相关性。完全培养基在没有细胞的情况下培养作为对照,不含可检测到的ATP。以100µL释放剂室温孵育5min测定培养HaCaT细胞ATP含量为最佳。图3和图4分别在24h和48h后显示了几个实验中细胞数量与ATP浓度的相关性。

数据显示用HaCAT细胞系测试的细胞系在荧光素 - 荧光素酶反应测定的细胞数和ATP之间存在显着相关性。为了表明ATP是增殖和/或细胞细胞毒性的指示剂,在添加两种不同的物质下进行测定。这些特性是透明质酸和露华格兰。透明质酸(HA)是外细胞基质的主要成分,普遍存在的浓度,在软结缔组织中具有最高浓度。


特别是透明质酸的影响与高浓度的高分子量HA吻合较好的事实抑制了几种细胞类型的运动,粘附和吞噬作用,而低浓度下的低分子量HA刺激细胞迁移,增殖和吞噬作用。


结论

该研究证实,HACAT细胞系中ATP的浓度可以通过荧光素 - 荧光素酶生物发光测定法测定,并且还可以使用对ATP生物发光的监测来用于测量增殖和/或细胞毒性。

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