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一孔三法:抗疟化合物库筛选

椎名麦高文 莫纳什大学生物化学和分子生物学系 03/2013
  • 金属氨肽酶M1, M17和M18是疟疾有吸引力的新靶点。
  • 通过测量一段时间内的吸光度和荧光,开发了一种检测方法来识别M1、M17和M18的抑制剂

表的内容

介绍

疟疾是一种热带疾病,是由疟原虫属的原生动物寄生虫感染引起的。每年约1,000,000人死亡与疟疾感染有关。这解释了对寻找抗动性化合物的高研究兴趣。

三种金属氨肽酶与疟疾感染相关:M1, M17和M18。这三种酶都是锌外肽酶,能催化蛋白质n端单个氨基酸的裂解。这种活性被寄生虫用来消化宿主机体的血红蛋白,是寄生虫生存所必需的。抑制肽酶活性的化合物可用于开发化疗策略。


非营利性的疟疾药物创制基金会(MMV)为研究界提供了一个复合图书馆(MMV400)。这些化合物以其抗疟活性而闻名,但不一定是分子靶标。在本应用说明中,我们介绍了一种检测系统来识别MMV400化合物是否针对一种或多种疟疾金属肽酶M1, M17和M18。

测定原理

为了避免浪费有限的化合物,开发了一种高通量的初始筛选,它足够强大,可以缩小活性化合物。由于这三种酶使用不同的底物,可以将这三种肽酶、它们的底物和400种化合物中的一种放入一个孔中。


荧光检测
M1/M17:甲基香豆素底物的裂解导致荧光信号,可在355 nm激发和460 nm发射下测量。


吸光度检测
硝基苯胺底物的裂解产生405 nm的吸光度信号。


通过来自BMG Labtech的微孔板读卡器,可以随时间准确监测德赢vwin官网客服吸光度和荧光变化。使用MARS数据分析软件完成测量后,可以评估所有数据。一键式测定计算模板非常简化数据处理,可以通过BMG LabTech定制定制。德赢vwin官网客服

材料与方法

  • 来自BMG LABTECH的多模式阅读器德赢vwin官网客服
  • NUNC的96孔透明板
  • MMV400抗疟复方文库
  • L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin-HCl(σ)
  • l -谷氨酸对硝基苯胺

在预测试中,显示出用于所有三种测定的单个缓冲液,并且3种蛋白酶不会干扰彼此的活性。优化蛋白酶和底物的正确浓度和体积,以在100%DMSO中具有200μL的终试样为200μL,包括20μl1mM化合物。


MMV400文库由5个96孔板组成,含有400个化合物,第1和第12列均为空。以16口空井为对照。在12个对照孔中,三种蛋白酶(PotP)和底物(PotS)都被移液,但没有化合物。在三个对照孔中,只有单一的蛋白酶,M1或M17或M18和基质混合物(PotS)存在,其余的对照孔包含我们实验室创建的PotP、PotS和一罐抑制剂(PotI)。汤锅和汤锅溶液是新鲜配制的。


移液顺序

  • 在适当的孔中加入DMSO和poi
  • 将80μl缓冲液加入所有孔,用多通道移液管
  • 在室温下留下5分钟
  • 3个对照孔分别加50 μl蛋白质,其余孔加50 μl PotP
  • 37℃温育10分钟,盖于板上
  • 用多道吸管在所有孔中加入50 μl的槽
  • 在37°C预热的酶标仪上读出分析结果


仪器设置

检测模式: 荧光和吸光度
阅读模式: 板模式动力学
周期: 25
周期时间: 300秒。



光学设置

M1 / M17检测: Ex355 / Em460
M18检测: 405 - 10

结果与讨论

图。图1显示了与M1 / M17活性相关的荧光的变化。

筛分的准确性仅取决于PotP+PotS活性(不含化合物)。正如预期的那样,这些控制在一段时间内给出了最高的信号增加。含有抑制剂的阴性对照随着时间的推移荧光没有明显的增加。活性化合物可以通过比较线性增加/分钟与两种对照。随着时间的推移,荧光增强越低,化合物的活性越强。鉴定出25个化合物对M1或M17具有活性。其中一些如图2所示。

没有发现M18的抑制剂(图3)。这并不奇怪,因为M18是一个高度特异性的酶,400个化合物并不是一个大文库。

进行辅助屏幕以确认结果并识别M1或M17作为目标。最终结果表明,只有2种化合物在二级筛选中不抑制。这导致盆栽测定的80%成功率。


结论

借助BMG Labtech多模微孔板读卡器德赢vwin官网客服,可以开发鲁棒的测定以确定针对金属氨基肽酶M1,M17和M18的活性化合物。通过利用仪器读取吸光度和荧光随着时间的推移,可以仅在节省有限量的化合物中进行三种测定。通过这种方法,只有在一天内只能筛选整个MMV400库,只有最小的实验室工作。

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