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384孔格式的时间分辨荧光(TRF)免疫分析使用匹配抗体对试剂盒和PHERAstar FSX

杰米坎贝尔(1)奥利弗卡尼(2) (1)Abcam,剑桥,英国(2)BMG Labtech,德赢vwin官网客服英国Aylesbury 12/2020
  • 重组单克隆抗体对一致,敏感和特定的结果
  • 适用于96-或384孔微孔板格式的基于ELISA的测定
  • 在Pherastar上的优化TRF检测提升灵敏度FSX.

表的内容

介绍

最具商业上可获得的抗体对设计用于三明治ELISA检测。它们提供小型化实验到384-甚至1536孔格式的流动,以获得更高的产量需求。Abcam的匹配抗体对(地图)具有良好的特征,重组抗体,具有高敏感的试剂,可覆盖各种靶标。地图包括未标记的捕获抗体,生物素化的检测抗体和蛋白质标准。为了增强测定性能,可以使用替代测量技术和不同的二级抗身标签。举个例子,时间分辨荧光(TRF)检测使用长寿命流量,称为镧系元素,其在激发后的较长时间内发光(微秒,而不是纳秒)。这有助于通过延迟测量开始直到背景信号衰减之后降低背景噪声。使用不可见光谱的测定信号的测量可以增加动态范围,并且不限于通过饱和度的相同程度。


在这里,我们描述了Abcam的地图套件如何在384井TRF免疫查询中使用(Delfia®trf - perkinelmer)并阅读PHERAstar®FSX.用于检测IRAK4,一种参与细胞信号转导的蛋白激酶,作为免疫应答的一部分。

测定原理

在Delfia.®TRF测定,地图与样品中的分析物结合,然后与链霉抗生物素蛋白 - 铕孵育,代替传统标签,例如HRP。使用Delfia检测到结合的链霉抗生物素蛋白 - 铕®增强溶液,释放有铕的铕,促进胶束螯合物溶液的形成。在337nm处激发铕螯合物,并在615nm处发射(图1)。


使用PHERAstarFSX.这可以用氙气闪光灯或激光激发来读取。在这个应用中,激光被用来最大化检测信号和灵敏度。

材料与方法

  • 黑色384 Nunc Maxisorp™板
  • 人类伊拉克4匹配抗体对套件(AB218182)
  • 德尔维亚®铕标记的链霉抗生物素蛋白
  • 德尔维亚®测定缓冲器
  • 德尔维亚®增强解决方案
  • PHERAstar®FSX.(德赢vwin官网客服BMG Labtech)

实验程序
根据Map Kit协议(1)使用黑384孔Nunc Maxisorbtm板的总体积为50μL的测定。将板孵育30分钟,用链霉抗生素蛋白 - 铕根据德尔维亚制造商的建议稀释®分析缓冲区。加入50µL的DELFIA后®增强解决方案,在BMG Labtech Pherastar上读取了时间分辨的流动德赢vwin官网客服FSX.配备一个扶轮基金会激光具有非优化和优化的设置。

仪器设置

光学设置 时间已解决的荧光(TRF),顶视图
光学模块 337 615(前:337纳米;
EM:615 nm)
激励源 激光
闪光数量 5.
集成开始 400μs.
积分时间 400μs.
一般设置 建立时间 0秒

成绩与讨论

的PHERAstarFSX.配备有激光激发源,光子计数检测器具有延长的红色检测范围,用于TRF测量。结合Z-height优化对于顶部和底光学器件,这确保了任何测定中的最高性能和灵敏度。该火星数据分析包配备PHERAstarFSX.能够自动产生校准曲线,从中可以确定未知样品的浓度。计算模板也可以保存到协议,这意味着测试运行的未来数据分析可以完全自动化。

荧光测量的最佳焦距取决于所用样品的体积和微孔板的尺寸。的PHERAstarFSX.当从顶部或底部读取板时,能够自动为光学选择最佳Z高度。图2中的曲线。图2示出了在(黄色)之前(黄色)和(蓝色)的Z高度的优化以前的384孔板中读取的样品。该调整改善了信号和信号到空白。

与在96孔板(图3)中的传统吸光度基于的ELISA测定中使用相同的地图套件获得的数据进行比较,以384孔格式的TRF基测定与人类Irak4地图套件相似,显示了类似的没有延长的工作范围,因为没有达到饱和度。对均为0.999的r2的测定来提供线性度。


结论

ABCAM的重组地图提供了用于基于板的免疫测定的检测方法类型的增强流动性。本申请说明表明,地图适用于小型化TRF免疫测定,提供灵敏度,特定城市和结果的再现性。这与384孔格式相结合,使地图套件特别适用于高通量筛选。可以通过ABCAM的PBS制剂实现额外的检测方法,这提供了更大的流动性。的PHERAstarFSX.能够优化读取条件,包括焦距,当与基于激光的激励源和光子计数检测相结合时,最大限度地提高灵敏度和信号窗口。当小型化到384孔微孔板时,这些优化和特性尤其重要高吞吐量筛选

参考资料

1.如何使用匹配抗体对套件 - 协议(ABCAM)

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