TR-FRET.

表的内容

什么是tr-fret?

时间分离的褶皱(TR-FRET)是一个结合的检测技术时间分辨荧光(基金会)与Förster的共鸣能量转移(FRET)。TR-FRET主要用于分析绑定事件和高通量药物筛选。


Förster的共振能量转移描述了两个荧光团之间的能量转移。它是以最初发展共振能量转移理论的德国科学家Theodor Förster的名字命名的。1为了使其发生,一个给予体荧光团在激发时吸收了能量并发现自己处于电子激发态,将能量转移到第二个接受体荧光团。能量的转移降低了施主的发射强度,而增加了受体的发射强度。


能量转移取决于两个条件。首先,供体和受体之间的空间邻近度必须在20 - 90 Å范围内。共振能量转移与供体到受体距离的六次方成反比,因此对距离的变化非常敏感。其次,施主的发射光谱和受主的激发光谱之间需要有重叠。“FRET对”需要在发射峰中有足够的距离以在光学上可区分,但同时有足够的光谱重叠以允许有效的能量转移(图1A)。


在生物学中,最常使用遗传编码的荧光蛋白。最受欢迎的包括绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)和青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。2


FRET通常用于研究分子相互作用或结合事件。通过将每个结合配偶体连接到荧光团,并通过检测所发生的能量转移水平来评估这些,并通过检测到所发生的能量转移水平(图1b,c)。然而,由于标准卷重受到散射激发光和自发荧光的背景噪声的负面影响,因此可以用这种方法几乎没有获得高敏感的测量。

TR-FRET原理

由于采用了时间分辨荧光和引入了延时检测,时间分辨FRET消除了由散射激发光和自荧光产生的短时间背景噪声。这是通过使用镧系元素作为供体而实现的。这些荧光团有很大的斯托克斯位移和发射寿命长达几毫秒。


tre - fret依赖于在镧系元素和短寿命荧光团近距离接触时发生的共振能量转移。由于这些特性,它比标准的FRET有更好的稳定性和特异性。通过长寿命的荧光以及对施主和受主两个发射波长的比率检测,缓冲或介质干涉显著减少。


在不同的设备制造商中,应用这项技术的一般原则是非常相似的,其中最流行的包括HTRF.®,兰斯®LanthaScreenTM值。供体和受体要么共价结合在相互作用的伙伴上,要么针对这两个目标(或标记)的特定抗体被标记在供体或受体上。通过激发供体,能量将转移到受体,如果目标在近距离,将发出荧光共振能量转移。输出与发生的绑定量成比例。

TR-FRET技术

在TR-FRET中,使用不同的荧光团,根据制造商使用形成不同的对。

  • 供体镧系元素是铕或铽(图2)。随着铕和铽离子的荧光性差,需要嵌入光收集的“笼子”中以发光。螯合和加密用于此目的,它们可以实现能量收集和转移。与铕相比,铽具有10-20倍的量子产率和更高的摩尔消光系数,涉及分子的吸光度。这两种功能都提高了筛选性能。3.螯合/隐酸镧配合物据说在各种化学条件下都非常稳定,而且不像传统的荧光团那样受光漂白的影响。
  • 受体是发出绿色和红色范围的常规荧光团。对于共振能转移,红色荧光团可以与铕或铽结合,而绿色荧光团通常与铽结合。

TR-FRET检测

镧系元素通常在320 - 340nm激发。铕的发射通常在620 nm处检测到,而铽则可以在490或620 nm处检测到,这取决于试剂盒和制造商。对于受体,绿色荧光团的发射波长为520 nm,红色荧光团的发射波长为665 nm。施主的发射被用作内部参考,而受主的发射是能量转移(结合事件)发生的指示器(图3)。

在激励和荧光检测之间,应用微秒范围的时间延迟。这消除了非特定的短寿命的背景荧光。然后通常在微秒(图4)的时间段(测量窗口)上检测到发射。根据套件和制造商,时间延迟和测量窗口设置可能不同。

然后计算与两个发光通道的时间随时间随时间的集成信号的比率。该比例测量落地信号,消除介质干扰和淬火,校正液体处理误差或井至井的变化。

TR-FRET的优点

灵敏度和多功能性使得TR-FRET测定很受欢迎。时间分辨检测和比率测量的组合显着增加了测定窗口并减少了背景。此外,镧系元素难以漂白,随着时间的推移是稳定的,并且与不同的试剂和实验条件相容。


尽管有这些益处,但这种方法的主要优点可能是绑定对的检测不需要与未结合的组件物理分离以减少背景。作为所谓的均匀测定,TR-FRET不需要在洗涤步骤之间,并且可以作为简单的添加和读取的测定(图5)运行,最大限度地减少处理步骤并更方便,更耗时而不是elisa。因此,它特别适合于自动化高温超导的筛选运动。

然而,由于与分子内激发过程的外部相互作用或文库化合物或生物蛋白的荧光而产生的信号猝灭可能是一个限制。3.


不同的tr-fret套件

TR-FRET测定套件可从不同的制造商提供。虽然所有测定都基于常见技术,但可以在A中检测到标仪套件和制造商之间存在差异。这些主要与不同的供体和受体类型,其组合以及检测开始和测量窗口的不同时间相关。

  • HTRF.均相时间分辨荧光是一种采用四种特定荧光团的技术,形成不同的对。镧系元素是铕或铽密码。受体在红色范围内发射:第一代XL665,基于从红藻类纯化的颜料,以及类似于XL665但尺寸较小的二代D2。

两者都可以与密码合并。另外,铽可以与绿色荧光团组合,允许电位复用(图6)。

  • :镧系元素螯合激发是一种基于铕螯合物和两种不同的受体分子的TR-FRET技术,SERLIGHT®APC和Ulight™。后者是具有较小分子量(<800道尔顿)的第二代改进的荧光团。
  • LanthaScreen:最初基于铕和Allophycocyanin (APC)或Alexa Fluor647,LanthaScreen最终是优化的,以使用铽和荧光素或GFP。使用铽应该增强灵活性。APC通常用作链霉抗生物素蛋白缀合物,因为其大分子量(> 100kDa),并在三分子复合物中偶联至生物素化的基材。与意见铽,荧光素和GFP组合可用于直接标记基材,克服铕-APC批量问题。此外,即使在活细胞中,GFP的使用使得能够基于GFP融合蛋白的测定。
  • 纸张®TR-FRET测定:检测常见生物酶反应的副产物ADP、AMP/GMP、UDP、GDP。每种核苷酸都有竞争的trfret免疫分析法。它们的定量被用于分析核苷酸依赖酶的酶活性。该Transcreener化验使用竞争性设置,其中抗体与铽螯合物结合,并将核苷酸与红色荧光团结合。通过“本机”ADP,AMP / GMP,UDP和GDP对示踪剂的位移可防止谐振能量转移。由此可以通过信号的降低来识别目标分子的存在。

表1总结了所有检测技术及其特征,包括激发峰和发射峰。除了概述的特征外,这些试剂盒的间隔时间和检测窗口也不同。欲了解更多详情,请查阅相应的用户手册。


表1:最流行的TR-FRET检测试剂盒及其激发和发射峰的比较

套件 捐赠者 笼型 励磁 排放 受体 排放
320海里 620 nm. ULightTM值 665海里
兰斯超 320海里 620 nm. Surelight®APC 665海里
lanthascreen欧盟 320海里 620 nm. AlexaFluor 647 665海里
lanthascreen tb. 340 nm. 490 nm. 荧光素/ GFP. 520 nm.
HTRF RED(EU) 穴状化合物 320海里 620 nm. XL665 / D2 665海里
HTRF红(Tb) 穴状化合物 340 nm. 620 nm. XL665 / D2 665海里
HTRF绿色(Tb) 穴状化合物 340 nm. 620 nm. 荧光素/ GFP. 520 nm.
透气仪TR-FRET 340 nm. 620 nm. HiLyte647 665海里

TR-FRET MIGROPPATE读卡器

主要是分辨的FRET检测主要进行微型板块的读者。TR-FRET板读取器的基本设置包括用于波长选择的光源,激励和发射过滤器和光电倍增管(PMT)检测器。此外,TRF检测模式外,板读数器必须能够在一个顺序或同时运行两个发射通道。由于TR-FRET主要用于高通量筛选,通常强制兼容384-和1536孔微孔板。

光源

螯合物或加密络合物通常在320-340nm处兴奋。因此,氙闪光灯或特定的激光灯都可以用作光源。一个TRF激光器在该特定波长范围内聚焦更多能量,并导致更好的结果,在低音和高信号之间具有更好的识别。


Pherastar FSX配备了TRF激光器,具有60赫兹闪光频率,为TR-FRET检测提供了显着的速度优势。激光允许在36秒内测量完整的1536孔板,同时保持Z'> 0.8用于细胞和生物化学测定(图7),如应用说明所示“在1536孔微孔板中测量的细胞和生物化学HTRF测定“。

专用探测器

Pherastar.FSX配备有用于TR-FRET检测的光子计数探测器(PMT)。普通探测器在集成时间期间提供了作为曲线下区域的集成值。相反计数PMT,而是计算每个单独的光子,从而监测整个镧系元素衰减曲线。


在Pherastar FSX读取器上,光子计数检测允许使用2微秒的时间分辨率测量和显示发射衰减曲线。这个独特的功能称为衰变曲线监测简化测定开发,有助于优化定时参数,改善检测和减少背景。与集成向导一起,衰减曲线监测为TR-FRET测定优化提供了平台。

双通道检测

两个发射波长的检测是必须的,要么是顺序的,要么是同时的。一般来说,微孔板读数器会依次测量两种排放物。然而,同时检测有几个优点。


同时双发射(SDE)pherstar上的探测系统FSX使用两个匹配的PMTs来平行测量两个发射波长。通过这种方式,SDE将读取时间减少了一半,并增加了吞吐量,同时纠正了由填充体积差异、浓度或激发能量波动引起的变化。这些特性提高了灵敏度,降低了%CVs。结合SDE单通道测量,对两个发射通道的结果进行了比值计算。

TR-FRET化验小型化

在药物筛选中,降尺度是一个关键步骤。小型化旨在减少样本量,同时保持重复性、可靠性和检测的稳健性。检测方法可以缩小到3456孔板- 384孔和1536孔格式是最常见的。


TR-FRET测定可以小型化,同时保持精度和再现性,因为信号强度不依赖于示踪剂的数量而是浓缩。这是通过使用Pherastar的德赢Vwin安全吗高度敏感的板读者进一步支持这一点FSX


在科学谈话中“成功缩小筛选测定:服务器经验“,我们展示了一个案例研究,私生动物FSX平板阅读器极大地促进了HTRF分析的小型化,从384孔到1536孔的格式。在PHERAstarFSX,微型化与进一步稀释试剂和“即时”检测相结合(每孔只有一个闪光)。这就产生了高质量的z'值显着减少试剂用量和时间消耗。

TR-FRET应用程序

TR-FRET用于分析生化测定中的结合事件。另外,它适用于基于细胞的测定,因为可以在培养基(均相检测)存在下进行细胞裂解物的测量。


不同的生物学环境包括蛋白质-DNA / RNA相互作用,蛋白质 - 蛋白(配体 - 受体)结合,激酶,包括GPCR,细胞因子和生物标志物的信号传导途径。


TR-FRET因其敏感性、较高的通量、可靠性和灵活性以及较少的假阳性或假阴性结果而在药物筛选界特别受欢迎。

分子相互作用

蛋白质之间和蛋白质与核酸之间的分子相互作用发生在细胞的每一个层次。这些包括表观遗传学。组蛋白修改活动)、信号转导(如g蛋白激活)、细胞通讯(如配体-受体相互作用)、基因调控等。


激酶活性测定

主要用夹层测定测量基材的磷酸化变化的夹层测定分析激酶活性。可以使用竞争测定,并监测反应产生的不同产品(例如ADP)。或者,使用FlOorestcented标记的激酶底物和标记标记的抗磷酸抗体(图8),如应用说明“Lanthascreen Tr-Fret酪氨酸激酶和蛋白激酶C测定“。这些方法也可以应用于蛋白酶和泛素。有关激酶活动检测的更多信息,请访问我们的博文“激酶测定“。

GPCRS.

分析研究G-蛋白偶联受体(GPCRs)既可以是机械性的,也可以是功能性的。功能分析主要关注二级信使的定量(如IP1或cAMP),因为这些可能会在细胞内积聚,作为特定抑制剂活性的结果。因此,第二信使被用作一个读出器,因为它们的浓度与配体结合和受体结合有关。有关资料载于“用于功能筛选的HTRF IP-ONE测定“和”使用Cisbio的CAMP和IP1 HTRF HTPPLEL小区的测定测量GPCR激活“。机械测定重点关注受体组织和寡聚化细胞膜以介导信号传导。


生物标记物

下游信号传导产品的分析可用于鉴定异常途径,可能在神经系统,代谢和炎症性疾病中发挥作用。可用于测试特异性靶向这些疾病的化合物的疗效。应用示例包括“快速HTRF胰岛素测定的发展“对于代谢疾病,特别是糖尿病和”人力蛋白质聚集的检测“在神经退行性疾病


动力学结合事件分析

由于技术困难和相对较低,传统上在药物发现的后期时间点研究了配体受体结合的动力学。然而,药物发现将极大地从他们的优化中受益,正如kon和koff率对效率,副作用的影响和效果和行动持续时间的影响。此外,绑定动力学似乎在偏见的激动主义中发挥作用。因此,理想的是在迁移到体内模型和临床研究之前,在早期点筛选药物候选物的结合动力学。


可以在板读数器上有效地执行结合动力学研究(图9),在板读数器上能够使TR-FRET动力学检测能够筛选目的和低亲和力化合物的动力学研究,如科学谈话中所讨论的“一种测量配体受体结合动力学的TR - 褶皱方法及其碎片筛选的应用“和应用笔记”分析与HTRF的结合动力学“。

其独特的特点,致力于动力学绑定研究,制作PherastarFSX优于目前市场上的任何其他微孔板阅读器。读取器可以很容易地解析绑定事件并计算K和K关闭由于其在trfret检测和专用的硬件/软件解决方案中的高时间分辨率。


参考资料

1.Förster, T.能量迁移与荧光。j .生物医学。Opt. 17,1(2012)。
2. Tsien,R. Y.绿色荧光蛋白。安努。Rev. Biochem。67,509-544(1998)。
3.Degorce et al。为药物发现量身定制的技术-理论方面和最近应用的回顾。Curr Chem Genomics 28,3,22 -32(2009)
4. Farino Z.J.等人AN294:开发快速HTRF胰岛素分析(2016)www.docksidequiltgallery.com/development-of-a-rapid-htrf-insulin-assay/

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