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Transcreener ADP2 FI检测在BMG LABTECH酶标仪上进行德赢vwin官网客服

弗兰卡·甘斯克(1) (1) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH (2) BellBrook Labs 12/2014
  • Transcreener®ADP.2FI测定套件是一种简单的一步竞争红荧光免疫测定,基于ADP的检测
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器与本试验兼容

介绍

账面®贝尔布鲁克实验室开发的技术,以量化生产ADP在酶反应。不同的检测模式可以与跨滤网结合使用®方法(* FI,FP和TR-FRET)。本申请笔记侧重于同质,竞争的红色ADP2荧光强度(FI)测定。该检测基于ADP的检测,因此与任何产生ADP的酶类兼容,包括蛋白质,脂质,碳水化合物激酶,atp酶,DNA解旋酶,羧化酶和谷氨酰胺合成酶。该检测方法是一种简单的一步均质检测方法,可应用于广泛的ATP浓度范围(0.1 ~ 100 μM ATP)。在本应用说明中,我们将说明增塑剂的组合®化学与BMG LABTECH微孔板阅读德赢vwin官网客服器提供优秀的Z’值,表明一个强大的分析和仪器。

测定原则

结束酶反应后,ADP Alexa594示踪剂与ADP结合2与IRDye结合的单克隆抗体®QC-1淬火器(由LI-COR授权®),是补充道。从反应中积累的ADP最终将取代抗体猝灭复合物中的ADP示踪剂到溶液中。在这里,附着物络合物变得不淬灭,导致荧光强度增加。酶反应过程中产生的ADP与荧光信号成正比

材料与方法

  • 黑色的384孔小体积板,来自德国格雷纳bio-one
  • 杂交ADP.2来自Bellbrook Labs的96洞井或384孔的Fi测定套件

为了显示仪器的潜力,创建了ADP/ATP标准曲线来模拟酶反应。对于10 μM的ADP和10 μM的ATP原液组合,给出了15个ADP范围从0到10 μM的标准。384孔板的反应混合液为10 μL的ADP/ATP稀释液和10 μL的ADP检测混合液。示踪剂在井中的最终浓度为4 nM。与QC-1猝灭剂结合的抗体的最终浓度取决于ATP的浓度。10 μM ADP/ATP稀释后,最终抗体浓度为5 μg/mL /孔®手册。高RFU对照和低RFU对照:

高RFU控制=阳性控制
0.5x缓冲器中的4 nm示踪剂

低RFU控制=负控制
检测混合,4 nM示踪剂和5 μg/mL抗体偶联于QC-1猝灭剂

将检测混合物加入标准品后,室温孵育1小时。然后将平板插入平板阅读器,将增益调整到阳性对照的10%,并测量荧光。

仪器的设置

POLARstar®ω CLARIOstar® PHERAstar®FS.
检测模式 荧光强度
方法 端点,顶级光学
光学设置 励磁过滤器:580-10
发射滤光片:620 - 10
单色器设置:575 - 20/630 - 40 轨道特定FIOGIC模块:FI 580 620

数据分析
Z’-值是评价高温测试方法的标准,其计算公式为:

式中,μp =“阳性对照”(最大比例)的平均值,μn =“阴性对照”(最小比例)的平均值,σ =相应的标准差。

成绩与讨论

图2和图3显示了在pherstar上监控的15点ADP/ATP标准曲线FS.或384孔格式的欧米茄读卡器。

Pherastar的标准曲线FS.和克拉斯塔尔看起来非常相似(Clariostar没有显示的数据)。对于欧米茄,标准曲线中误差条略高。这是由于欧米茄仪器中使用的不同光学系统。

随着每一个BMG LABTECH阅读器附带的火星数据分析软件,它可以计算不同的分析参数,如Z´值只需点击鼠标。德赢vwin官网客服表1总结了不同仪器的Z´值结果。

表1:与不同的BMG Labtech仪器相比,透气测定的Z'值德赢vwin官网客服

PHERAstarFS. CLARIOstar Polartar / Fluostar Omega
Z'Value(384孔)在10%转换时使用5次闪光 0.89 0.83 0.80

表2:CLARIOstar®在10%转化率10 μM ATP下的测定性能

闪烁 1 2 3. 4. 5.
阅读次数(分钟)整384孔板 收窄 1:31 :43 发布会 3:01
Z'Factor以10%ATP转换 0.67 0.83 0.85 0.87 0.89

获得增滤器的标准®FI认证是在10% ATP转换时达到0.7的Z’因子。如表2所示,如果只使用5次闪光,整个384孔板的读取时间为1:31,则Z '值已经达到。这说明使用LVF单色仪在CLARIOstar上进行测量是快速和可靠的。

结论

我们展示了杂交®ADP.2FI分析与PHERAstar兼容FS.克拉罗星、北极星和欧米茄。

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