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在ClarioStar多模微孔板读卡器上使用UV荧光测量的色氨酸定量

MarkGröneFrankaMaurer 德赢vwin官网客服 07/2014
  • 色氨酸稀释曲线在广泛的浓度范围内显示线性度
  • 敏感性被确定为<2nm色氨酸
  • 激励滤波器和LVF单色器的组合TM值用于发射提供优异的UV荧光

概要

色氨酸是必不可少的氨基酸,因为它不能被人体生物合成,但需要用食物进行摄取。除了其在饮食学的重要性外,由于它荧光以来,色氨酸获得了兴趣。位于蛋白质内的色氨酸的荧光与来自表面静置色氨酸的荧光不同。这用于研究蛋白质折叠。

荧光强度色氨酸的含量可以用BMG LABTECH的酶标仪检测到德赢vwin官网客服www.v66088.com 低至<2nm的浓度。荧光团色氨酸在高浓度范围内给出线性信号,而不管使用过滤器或用于激发的滤波器的组合,而且LVF单色器用于排放。因此,Clariostar®是一种用于色氨酸荧光测量的敏感工具。

介绍

色氨酸是构成蛋白质的22种氨基酸之一。它是人类饮食中的一种必需氨基酸,因为它不能由人体组织合成,必须从食物中外部摄取。此外,色氨酸被用作神经激素、神经递质以及维生素的前体物质。

由于色氨酸的基本性质,它是研究最多的氨基酸之一。最初,研究人员的目标是找出含有高色氨酸含量的营养物质作为膳食建议。色氨酸的芳香族残留可以用吸光度法检测(图2),所以首先用分光光度法测定色氨酸(图1)。

随着分析仪器的进一步发展,研究人员意识到可以利用色氨酸测定来利用荧光。此外,观察到蛋白质内色氨酸的位置影响其荧光。特别地,如果芳族色氨酸残留物存在于蛋白质的表面上,与当色氨酸位于蛋白质内时,荧光比可以捕获的荧光要高得多。

由于这种观察,荧光可用于确定蛋白质的构象状态及其折叠过程。


在此应用笔记中,我们使用Clariostar多模微孔板读卡器从BMG 德赢vwin官网客服Labtech进行荧光强度检测测量色氨酸。Clariostar可以使用过滤器或组合过滤器和LVF单色器TM值用于准确敏感的色氨酸。


材料与方法

  • 左旋色氨酸从SigmaAldrich
  • PBS从Biochrom
  • 来自Greiner的96孔UV-星微孔板
  • www.v66088.com 来自BMG Labtech的微孔板读卡器德赢vwin官网客服

标准曲线的制备
在PBS缓冲液中制备10μM色氨酸储备溶液。从库存中,制备10点稀释液,含有表1中所示的浓度。纯PBS缓冲液用作坯料。在96孔板的每个孔中,300μl标准或坯料被移液。对每个标准和18个坯料的三倍一倍增加。

表1:色氨酸稀释系列

内容 浓度
(m)
内容 浓度
(m)
S1 5.0 e-6 S6 5.0 e-8
S2 2.5E-6 S7 2.5E-8
S3 1.0E-6 S8 1.3 e-8
S4 5.0 e - S9. 6.3E-9
S5 1.0E-7 S10 1.3 e-9
空白 0.

仪器的设置

测量方法: 荧光强度,端点模式
闪光次数: 100.
安定时间: 0.2

光学设置

使用过滤器 - LVF单色仪组合
励磁 二向色 排放
F:280-12 自动单色器 单色仪362-25
使用过滤器
励磁 二向色 排放
F:280-12 F:TRP-LP F:360-20.

进行自动焦点和增益调整以获得最高动态范围。填充体积为300μL的最佳聚焦导致11.0mm。固定增益和聚焦值用于具有相同填充体积的板与板比较。


敏感度(LOD)计算
根据IUPAC标准计算LOD:


lod = 3 * sd空白/坡标准曲线


成绩与讨论

标准曲线测量显示色氨酸浓度和荧光输出在宽浓度范围内的高线性关系(图3)。


使用发射滤波器或发射LVF单色仪都不会影响测量的灵敏度和准确性,这表明LVF单色仪具有滤光片般的灵敏度。

结论

本应用笔记中显示的数据表明,CLARIOstar可以进行精确和高灵敏度的色氨酸荧光测量。检出限< 2 nM。这相当于色氨酸浓度为0.4 ng/ml。这种灵敏度可以用激励和发射的滤波器来实现,或者用激励的滤波器和发射的LVF单色器来实现。

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