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实时泛素化监测:基于荧光偏振的UbiReal方法

泰勒g富兰克林乔纳森n普鲁内达 俄勒冈健康,科学大学,分子微生物学与免疫学学系,波特兰,美国 05/2020
  • UbiReal可以实时跟踪泛素结合和解结合的所有阶段
  • 荧光标记的泛素用FOR FOREOR倒数极化以高吞吐量格式
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech提供了由MARS数据分析补充的优异流动偏振敏感性

表的内容

介绍

蛋白质泛素是调节各种生物过程的重要组成部分。尽管泛素化通常与蛋白酶体降解有关,但在免疫信号传导和细胞周期调节中的作用也已经识别。通过一种物种的多种 - 泛素化形式具有单独的调节作用,可以进行调节的多样性。


正如预期的那样,泛素化失调与许多疾病有关,包括癌症和自身免疫疾病。因此,研究努力寻找纠正失调的方法,最近又试图利用蛋白质靶向嵌合分子(PROTACs)泛素化的蛋白质降解能力。由于缺乏研究蛋白质泛素化周期所有阶段的工具,这些努力受到了阻碍。


这里我们描述一个简单的高吞吐量筛选(HTS)测定叫ubiveal1。利用荧光偏振(FP)技术,可以跟踪荧光标记泛素(Ub)的共轭和解共轭状态。德赢vwin官网客服BMG LABTECH的CLARIOstar微孔板读卡器以其优异的FP性能而闻名,这在本应用中得到了展示。

测定原理

在人类中,泛素化是由数百种蛋白质控制的,这些蛋白质被广泛地分为作者、读取者和擦除者。作者由E1 Ub活化酶、E2 Ub接合酶和E3 Ub连接酶组成,它们依次作用于Ub的转移(图1A,步骤1-4)。Ub信号然后由Ub结合蛋白解释,称为解读器,直接适当的细胞结果。信号转导后,被称为去泛素酶(DUBs)的橡皮蛋白将Ub修饰去除并回收(图1A,步骤5)。


FP可以用来监测分子在溶液中的旋转,理解为较大的分子旋转较慢,从而显示较高的FP值。之前的研究结果表明,单聚ub链可以根据FP信号的变化来区分2。这就导致了对荧光Ub的FP监测是否能够区分泛素化级联中的不同状态的研究。代表在图1 b的数据显示:1)结合标记乌兰巴托的E1 FP造成一个大转变,2)形成的E2 ~乌兰巴托共轭FP略有减少,3)过渡到一个E3 ~乌兰巴托共轭展品FP的检测增加2,4)接合的额外标记观察到乌兰巴托FP时间增加,和5)去除乌兰巴托的配音和FP下降明显。

材料与方法

  • Greiner,黑色,384孔,小体积,HiBase微孔板
  • www.v66088.com
  • 蛋白质的获得、表达和纯化如Franklin & Pruneda所述1
  • 从商业来源获得化学品

实验的程序
样品用最终体积为20µL的主溶液制备,缓冲成分为25 mM磷酸钠(pH 7.4)、150 mM氯化钠、10 mM MgCl2和100 nM TAMRA-Ub。


在E1抑制试验中,加入0.5µL不同浓度的抑制剂PYR-41在DMSO中,或单独DMSO作为对照,加入到同样含有125 nM E1的主溶液中。使用以下设置监测FP 10个周期,此时手动暂停测试,加入1µL ATP启动反应([final]= 5 mM),监测持续70分钟。


仪器的设置

视镜设置 荧光极化,板模式动力学
过滤器:Ex: 540/Di: LP566/Em:590
通用设置 闪光次数:20孔每周期
安定时间:0.1秒
动态设置 循环次数:187或120
循环时间:40或41秒

数据分析
使用MARS数据分析软件计算FP值和测定质量的指标Z’,使用软件中可用的公式。此外,计算平均值,并使用在加入ATP之前观察的10个周期的信号进行基线校正。


结果与讨论

图1B显示,UbiReal方法可以监控泛素化周期的所有阶段。然而,预计大多数的研究,包括药物发现,将集中在通路的孤立步骤。因此,我们试图以一种更加集中的方式评估UbiReal的性能。


图2显示了TAMRA-Ub偶联E1的分析结果。此外,它显示了如何使用这种测定方法来评估化学抑制的效果。具体来说,这表明了已知化学抑制剂PYR-413的浓度依赖性效应。检测质量数据(Z ' =0.59)表明该检测方法适用于高温闷热试验。

此外,ubireal方法用于研究E2S,E3S和DUB的活性在更聚焦的测定(这里未显示的数据)中。发现所有基于Z的测定质量评估适用于HTS1


结论

UbiReal方法解决了评估Ub结合和解结合活性的通用HTS分析的需要。该方法具有许多吸引人的特点(方便、定量、健壮和可扩展),这将使其对机械工作和小分子高温测试有用。BMG LABTECH优秀的FP检测和数据分析很好地补充了这一有用的分析方法。德赢vwin官网客服


参考文献

1.富兰克林,T.G.和Pruneda,J.N.用于实时监测泛素化的高通量测定。面前。化学。(2019)7:1-11。
2.叶,y,等。USP域去泛素酶USP21的多泛素结合和交叉反应性。EMBO代表(2011)12:350 -357
3.杨,杨等。泛素激活酶(E1)抑制剂,一类新的潜在的癌症治疗药物。Cancer Res.(2007) 67: 9472-9481。

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