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使用BMG Lab德赢vwin官网客服tech微孔板读卡器监测淀粉样蛋白形成

莎拉·沙玛斯·安·克里斯汀·布罗森 剑桥大学化学系 01/2008
  • 紫杉醇蛋白质聚集意味着几种退行性疾病
  • 随后使用BMG LABTECH酶标仪进行蛋白质聚集动力学分析德赢vwin官网客服
  • 自定义脚本允许定时出原位实验

介绍

淀粉样蛋白Fi Brils涉及许多疾病,称为淀粉样蛋白病,包括II型糖尿病和阿尔茨海默病。每种疾病与特定蛋白质的错误折叠有关,该蛋白质进入在体内器官中作为斑块积聚的线性聚集体(Fi Bils)。可以在聚集过程中形成各种不同的物种,包括称为原始夹层的线性前体,其通常出现在早期阶段中。有证据表明淀粉样蛋白形成可以是多肽链的通用性质,即在适当的(部分稳定的)条件下,“任何”蛋白质将形成淀粉样蛋白。尽管这种特性,但很明显,氨基酸侧链有助于淀粉样蛋白聚集体的稳定性和形态,以及它们的形成动力学。在该研究中,淀粉样蛋白形成蛋白V的各种突变体已经设计用于研究突变对聚集行为的影响。


已经显示为与淀粉样蛋白FiRIS结合的一组Fl荧光染料是苯胺萘磺酸(ANS)。这些染料不是“淀粉样蛋白标记”;它们通过表面上暴露的疏水贴剂与蛋白质结合。在该研究中,染料BIS-ANS已经用于遵循蛋白质V和突变体的聚集过程,以提供有关动力学的信息和所形成的淀粉样蛋白聚集体的疏水性质。

在本报告中,我们证明BMG Labtech微孔板读者可以通过进行流动性动力学研德赢vwin官网客服究来监测淀粉样蛋白形成。我们已经特别使用了脚本模式功能,允许我们使用简单的过程来进行定时的EX原位测量。本研究中使用的模型蛋白质v与淀粉样疾病有关。


材料与方法

双ans荧光监测聚合动力学

为了防止聚集过程通过在反应混合物中包括染料的任何干扰,制备出原位测量。在各种时间点除去聚集混合物的等分试样,并加入到双α的缓冲溶液中(从荧光测量的Sigma-Aldrich获得)。这种方法意味着井板中的每个孔都代表动力学测定中的单一测量。我们使用BMG LabTech的脚本模式设计了一个脚本,允许我们德赢vwin官网客服准确地探测每个时间点的流动性能。该脚本以允许连续井的允许流动速度的速率进行一系列标准流动倒数协议。另外,它在适当的时间内进出旋流来辅助采样,并记录每个样品的反应时间。通过选择要将数据导出到CSV FI LE的数据,可以将连续测量(以及相应的反应时间)的结果中记录在一个可以通过一系列商业和免费软件程序打开和分析的单一文件中记录。


程序
缓冲剂A:50mM磷酸钠中的10μmbis-ans
缓冲pH值7.4
缓冲液B: 50mm磷酸钠缓冲液pH 7.4

i.每一个测量井都应该准备一个方案。除了井数之外,这些协议本身都是相同的。仪器设置如下:

  • 类型:荧光慢动
  • 激发滤波器波长:400nm
  • 发射波长:500nm
  • 温度:30°C
  • 没有震动

II。选择CSV FI LE格式 - 还选择以下选项:

  • 将数据附加到FI LE的末尾(而不是更换以前的数据)
  • 输出文件名为
  • 报告样式,例如输出相关变量的短标题。我们的脚本使用表示反应时间

III。将板插入BMG Labtech微孔板读卡器德赢vwin官网客服
四、开放的脚本
v。编辑脚本:为CSV输出选择FI Lename i.e.
VI。保存并运行脚本(从现在开始脚本提示所有操作)
7移液45 μL A、5 μL B在第一口孔中作为对照。
VIII。首先进行测量。
9按回车键开始倒计时。30秒后,哔哔声响起,提示将缓冲液B加入到蛋白V中,蛋白浓度为30 μM。
X。将45μla和5μl聚集混合物移液管进入下一孔
XI。进行测量

重复X-XI,直到收集了SUF CIEN数据,然后停止脚本。


最终构建不同突变体的Bis-ANS荧光强度标准浓度曲线。在45 μl缓冲液a中加入不同体积的成熟纤丝(30 μM),在50 μl缓冲液B中保持bis-ANS浓度不变。

成绩与讨论

图1显示了蛋白质V(X和W)的两个突变体的聚集过程的动力学图。在时间= 0 S蛋白质x具有非常低的荧光信号,这增加直到它达到7000秒的相当稳定的水平。增加可能代表单体与疏水表面的成熟化合物转化为成熟。与蛋白质W的流晶相同,与蛋白质X相同的时间尺度,但是蛋白质W的信号始终约为2500A.u。高于蛋白质X的信号。蛋白W的非零初始流荧光表明聚集体的存在,在实验的死区时间内迅速形成,能够结合双α。这些不形成蛋白质x是有趣的,因为通常认为早期的低聚物代表淀粉样疾病中的有毒物质(而不是FIRIS)。在BIS-ANS信号稳定后发现的蛋白W的较高凌镜荧光信号表明,由该突变体形成的成熟聚集物种也比由蛋白质X形成的物种更疏水。聚集物种之间的疏水性质的差异也有趣的研究由于疏水性物质可以通过与体内细胞膜相互作用来介导毒性。
在更长的时间内还研究了蛋白V和另一个突变γ的双-Ans结合。在聚集条件下留下蛋白质3周,允许FIRBIR形成。然后除去等分试样以产生每种蛋白质的标准浓度曲线(参见图2)。


对数据进行线性FITS,表1中显示了每个蛋白质的梯度和r值。对于蛋白质v,然而,尽管蛋白质y差,但尽管蛋白y差。这可能重新进一步是一种非常异因的物种(由TEM观察,数据未显示)。蛋白Y还具有比蛋白V的低初荧光信号,表明疏水表面较少。

蛋白 梯度 R.
V. 2135±91. 0.95
y 740±76. 0.72

结论

在本报告中,我们已经证明了BMG Labtech微孔板读者可以使用使用流荧光测量来德赢vwin官网客服遵循蛋白质聚集动力学。特别是我们已经表明,使用脚本模式,可以简单地制作定时的EX原位测量,创建输出到单个CSV FIE。

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