112.

使用BMG L德赢vwin官网客服ABTECH微孔板阅读器监测白细胞在稀释血液中的生成自由基

西玛·拉蒂夫,保罗·R·英格拉姆,科琳·M·斯皮科特 斯特拉斯克莱德大学免疫学系 05/2007
  • 自由基的超敏分析
  • 需要非常小的血容量(0.2μl)
  • 同时注射,摇动和测量

介绍

abel.®(通过发射的光分析)全血样品和分离细胞的细胞活化试剂盒用于分析呼吸爆发期间白细胞的自由基和其他反应性物种的实时生产。这些化学发光测定试剂盒(由骑士科学有限公司开发和制造)涉及使用发光蛋白致苯磷酸蛋白®以及细胞兴奋剂PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate)和fMLP (n-甲硫酰基-亮基-苯丙氨酸)。

盗贼®是由骑士科学有限公司(KSL)分离和纯化的光蛋白,来自生物发光MOLLUSC,Pholas Dactylus,普通的Piddock。在测定中,胆素®在受刺激白细胞的自由基和NADPH氧化酶系统产生的活性物种存在时发光。采用1:100稀释的血液20 μL(相当于0.2 μL全血),最终体积为200 μL,检测结果超灵敏。光是在BMG LABTECH微孔板阅读器中测量德赢vwin官网客服的。


材料与方法

材料购自以下制造商:

  • 亚伯®细胞激活检测试剂盒的全血或分离细胞与酚醛酶®和Adjuvant-KTM
  • 骑士科技有限公司
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板读者用试剂喷射器。

采集当天,将血样抽入含有EDTA的5ml减压瓶中进行分析。所有其他需要的试剂都随试剂盒一起提供,并按照试剂盒提供的说明进行准备。用这些试剂制备微孔板,并按照提供的详细方案稀释全血样本。从每个样本中分离血浆,作为相应全血样本的对照。


将所有样品一式三份测定。在制备微孔板之前,注射器用细胞刺激剂施用于细胞刺激剂:用PMA和注射器2用FMLP注射器1。温度也设定为37℃。一旦准备就绪,将板插入读取器中以允许试剂和样品在测量发光之前达到37℃。在此期间,使用以下参数设置仪器:

用pma:

模式: 盘子
获得: 3300 - 3500(取决于读者)
测量: 时间/:1 s
定位: 延迟:0.1秒
震动: 轨道,测量期间
周期: 该参数从分析的样本数量自动计算,即被测量的孔的数量,并适当地调节用于在特定的96孔板上测定的样品的数量。
周期: 这是根据循环时间除以循环时间的板模式内的总测定时间来计算。

PMA在60秒后注射,因此根据每个特定化验的周期时间计算注射发生的周期。


fMLP:

模式: 好吧
获得: 3300 - 3500(取决于读者)
不。时间间隔: 200
测量时间/孔: 2 s /
定位延迟: 0.1秒
注射2开始时间: 60年代
震动: 轨道,测量期间

实验结束后,用水,10mm NaCl(aq),水,50%乙醇冲洗注射器,最后用水冲洗。彻底清洗对喷油器的正确维护非常重要。

成绩与讨论

将发光作为每秒相对光单元(Rlu / Sec)测量。测量的光发射的增加说明了在刺激后呼吸爆发期间通过活化的白细胞释放的自由基的存在。使用FMLP,通过与等离子体膜上的受体结合来激活NADPH氧化酶,呼吸爆发几乎立即开始(在约5秒内),从图1中的信号峰的增加可以看出。

响应在2-3分钟后开始尾转。响应于PMA(图2)观察到更长的滞后时间(图2),该PMA进入细胞并通过直接激活蛋白激酶C激活NADPH氧化酶系统。用PMA血浆膜的NADPH氧化酶系统和白细胞的二级颗粒是活性。图2显示了在测量时间的初始分钟之后测量45分钟的发光的结果45分钟。信号增加到最大水平,然后变成恒定。使用血浆作为对照来测量基线发光,因为它不含细胞。

使用BMG LABT德赢vwin官网客服ECH微孔板阅读器来测量这些实验中发出的光有许多优点。在0.2 μL的血液(平均含有500个中性粒细胞)中检测白细胞产生的自由基的灵敏度足够。


自动注入器能够同时注入细胞刺激物和测量发光,这是注射fMLP的最大优势。fMLP的刺激是通过与受体结合导致超氧化物的快速产生而启动的(2-5 s延迟时间),这可以通过唇蛋白酶快速增加的光发射来检测®。保持温度控制的能力使测定可以在生理温度下进行。在全血试验中特别重要的是微孔板在震动时的光测量能力;这一特性确保了血细胞和所有试剂在试验过程中处于悬浮状态。温度控制和震动是获得良好重现性的重要因素,并确保观察到的结果的任何差异是由于白细胞活性的固有差异。

Abel是骑士科学有限公司的注册商标

去顶级