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使用CyDye荧光剂在BMG LABTECH荧光微孔板读卡器上进行改进的FRET蛋白酶分析德赢vwin官网客服

珍妮特·乔治·克里斯托弗·诺里 通用医疗保健有限公司 05/2007
  • 改进了BMG Labtech读者和Cydee™标记肽的测定德赢vwin官网客服平台
  • 与传统荧光剂相比,荧光增强显著
  • 开发CyDye™标记底物以控制MMP活性

介绍

基质金属蛋白酶(MMP)家族成员在组织重塑和修复中发挥重要作用。然而,不适当的MMP活性涉及许多疾病状态,包括关节炎、肿瘤侵袭和转移,以及心血管疾病。开发控制MMP活性的药物仍然是制药工业的一个主要焦点。


已经描述了许多合成的MMP肽底物,其掺入荧光团和位于酶切割位点的任一侧上的猝灭剂部分。我们准备了一些CYDYETM标签MMP的基质。与传统使用的荧光剂相比,用特定的MMP酶切割这些底物会在供体荧光团波长处产生改善而显著的荧光增强(图1)。

的POLARstar®ω和PHERAstar®FS有2个光电倍增管(PMT),因此不必切换过滤器或偏振器来读取第二通道,同时双发射(SDE)使分析像焦躁更快和更精确。


材料与实验

肽基材:
使用标准合成和标记程序合成并用活性细胞(Amersham Biosciences)合成并标记肽。通过RP-HPLC纯化并通过质谱法确认纯度,将双标记的肽冷冻干燥。在使用之前,将标记的肽基材(表1)溶解在DMSO中,储存在-20℃下储存。肽MCA-PLGL-DPA-AR-NH2作为冷冻干燥的粉末(CN Biosciences),根据制造商的说明溶解在甲醇中。

表1:用于裂解实验的肽序列

肽我 CY3B-​​PLG↑raark-cy5q
肽II CY3B-​​PLG↑LFARK-CY5Q
肽三世 Mca-PLG↑L-Dpa-AR

Mca (7-Methoxycoumarin-4-yl)乙酰基
DPA,3-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙酸

激活MMP-2:
人重组MMP-2前酶(CN Bio-sciences)在37°C含4-氨基苯基乙酸汞的实验缓冲液中孵育2小时。


标准试验:
标记多肽(400 nM)在37°C孵育,加入或不加入激活的MMP-2酶在实验缓冲液中(50 mM Tris pH 7.5,含150 mM NaCl, 10 mM CaCl)2,10μmzncl2, 0.05% (w/v) BrijTM-35和0.05% NaN3.)。测定用黑色、不透明的384孔板(Greiner)进行,最终反应体积为60 μL。在BMG LABTECH荧光读卡器上以3德赢vwin官网客服20/390 nm和530/570 nm的激发和发射波长对Mca和Cy进行读片TM分别3 b。


成绩与讨论

我们已经制备了两种MMP底物,其中包含Cy3B和Cy5Q作为荧光团/猝灭剂对。在一系列的实验中,我们将这些结果进行了对比,并将其与表征良好的多肽Mca-PLGL-Dpa-AR进行了比较。MMP-2水解底物的时间过程被建立(图2),所有三个肽都被发现有效地裂解。

在测定端点,我们计算三种肽的信号/背景(S / B)值和肽I和II的公认的Z'统计因子(表2)。总体而言,结果表明,肽II是MMP-2更有利的基材。


表2:MMP-2测定汇总统计。

BMG POLARstar
S / B Z”
肽我 25:1 0.95
肽II 49:1 0.93
肽三世 9:1 nd

结论

我们在MMP-2酶的FRET蛋白酶裂解实验中使用了CyDye fluors。结合荧光供体(Cy3B)和Cy5Q猝灭剂的底物在去猝灭试验格式中与含有甲基香豆素荧光和二硝基苯猝灭剂的等效底物进行了比较。


所有的肽底物(图2)都被MMP-2酶有效地水解。在BMG LABTECH荧光微孔板读取器上测量,CyDye标记底物水德赢vwin官网客服解后的信号增加为>的25倍,而Mca/Dpa标记底物水解后的信号增加仅为9倍(通过时间过程分析评估时)。对于这两种CyDye标记肽,在控制井(不含酶)中没有观察到显著的信号增加。与传统的荧光剂(如Mca)相比,CyDye标记肽和BMG LABTECH reader检测的结合提供了一个改进的检测平台。德赢vwin官网客服


两种Cydee肽在P2'位置不同(表1)。其他具有特征在于该网站的特异性底物含有色氨酸或DPA。本文介绍的数据表明,苯丙氨酸也是底座P2'中的良好残留物。这符合MMP酶赞成P2'的芳族侧链的观察。

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