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使用Cydee Fluors对BMG Labtech荧光微孔板读卡器的改进的FRET蛋白酶测定德赢vwin官网客服

Jeannette George Christopher Norey GE Healthcare UK Limited 05/2007
  • 改进了BMG Labtech读者和Cydee™标记肽的测定德赢vwin官网客服平台
  • 与传统群体相比,增强和显着的荧光增加
  • 开发Cydee™标记的基材以控制MMP活性

介绍

基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员在组织重塑和修复中起着重要作用。然而,不适当的MMP活性涉及许多疾病状态,包括关节炎,肿瘤侵袭和转移和心血管疾病。代理商的发展,以控制MMP活动仍然是制药行业的重点。


已经描述了许多合成的MMP肽底物,其掺入荧光团和位于酶切割位点的任一侧上的猝灭剂部分。我们准备了一些CYDYETM值标记的MMP基材。与传统上使用的氟更频相比,具有特异性MMP酶的这些底物的切割产生改善和显着的荧光增加(图1)。

偏光棒®欧米茄和特异菜®FS.有2个照片乘法器管(PMT),因此不必切换过滤器或偏振器读取第二通道,同时双发射(SDE)使得像摩擦更快,更精确地进行测定。


材料与实验

肽基材:
使用标准合成和标记程序合成并用活性细胞(Amersham Biosciences)合成并标记肽。通过RP-HPLC纯化并通过质谱法确认纯度,将双标记的肽冷冻干燥。在使用之前,将标记的肽基材(表1)溶解在DMSO中,储存在-20℃下储存。肽MCA-PLGL-DPA-AR-NH2作为冷冻干燥的粉末(CN Biosciences),根据制造商的说明溶解在甲醇中。

表1:裂解测定的肽序列

肽I. CY3B-​​PLG↑raark-cy5q
肽II CY3B-​​PLG↑LFARK-CY5Q
肽III MCA-PLG↑L-DPA-AR

MCA,(7-甲氧基苏马林-4-基)乙酰基
DPA,3-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙酸

激活MMP-2:
通过在37℃下在含有4-氨基苯基汞乙酸酯的测定缓冲液中孵育2小时,通过在37℃下孵育来激活人重组MMP-2酶(CN生物科学)。


标准测定:
将标记的肽(400nm)在37℃下在37℃下在测定缓冲液(50mM Tris pH 7.5中,含有150mM NaCl,10mM CaCl的50mM Tris pH 7.5中的活化MMP-2酶孵育或不含活化的MMP-2酶。2,10μmzncl2,0.05%(w / v)brijTM值-35和0.05%楠3.)。在最终反应体积为60μL的黑色,不透明384孔板(GRENER)中配置测定。使用320/390nm和530/570 德赢vwin官网客服nm激发和MCA和CY的发射波长在BMG Labtech荧光板读卡器上读取板TM值分别为3B。


成绩与讨论

我们制备了两个MMP底物,其包含Cy3b和Cy5q作为荧光团/猝灭剂对。在一系列实验中,将它们彼此进行比较,并且具有良好表征的肽MCA-PLGL-DPA-AR。建立了通过MMP-2水解基质的时间过程(图2),发现所有三种肽都有效地切割。

在测定端点,我们计算三种肽的信号/背景(S / B)值和肽I和II的公认的Z'统计因子(表2)。总体而言,结果表明,肽II是MMP-2更有利的基材。


表2:MMP-2测定的概要统计数据。

BMG Polarstar.
S / B. Z'
肽I. 25:1 0.95
肽II 49:1 0.93
肽III 9:1 n

结论

我们在FRET蛋白酶切割测定中使用Cydee氟化物,用于酶MMP-2。将荧光供体(Cy3b)与脱淬的测定形式中的Cy5Q猝灭剂组合的底物与包含甲基 - 香豆素氟和基于二硝基苯基的猝灭剂的等效基质进行比较。


所有肽底物(图2)通过MMP-2酶有效地水解。在BMG Labtech荧光微板读取器上测量的信号增加,在标记基材的德赢vwin官网客服水解后的水解后> 25倍,与MCA / DPA标记底物水解后的9倍信号增加相比(当通过时间课程分析评估时)。对于两个Cydee标记的肽,在对照(无酶)孔中没有观察到显着的信号增加。与比较传统上使用的氟氯虫(如MCA)相比,BMG Labtech Reader上的Cydye标记肽和检测的组合提供了改进的测定平台德赢vwin官网客服。


两种Cydee肽在P2'位置不同(表1)。其他具有特征在于该网站的特异性底物含有色氨酸或DPA。本文介绍的数据表明,苯丙氨酸也是底座P2'中的良好残留物。这符合MMP酶赞成P2'的芳族侧链的观察。

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