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使用基于fret的蛋白质复合物测量,以确定化学计量与工作图

Francesca Mattiroli (1) Gu Yajie (1,2) Karolin Luger (1) (1)美国科罗拉多大学波尔得分校化学系。学生物化学。。(2)科罗拉多州立大学生物化学系。u。摩尔。杂志。Fort Collins, CO, USA 09/2019
  • 测定蛋白质-蛋白质相互作用的化学计量是根据观察到的FRET最大值
  • clarostar采用384口井的平板形式测量FRET和相关控制,最多可进行4次交互
  • 化学计量学的测定由MARS数据分析模板辅助

表的内容

介绍

化学计量学的测定对于理解生化反应是很重要的,因为这些反应依赖于至少两种细胞成分的相互作用。测量这些相互作用已被限制于观察大分子量变化的有用方法,如尺寸排除色谱。此外,这些方法需要大量纯化的细胞成分。


考虑到这些局限性,我们试图提供一个可以观察蛋白质-蛋白质相互作用的平台。在此,我们将描述工作图的一个改编1。我们的方法使用microplate阅读器,它被用来读取FRET和相关的受体和供体控制强度。使用酶标读卡器可以在384孔板上使用小样品量(40 μl)。此外,在单个板上可以研究4种单独的相互作用。

测定原理

作业图的一个关键因素,也称为连续变分法,是保持2个分子的总浓度不变2。它是两个分子改变的比例。一个可观察到的参数与复杂的形成成正比,在这种情况下,标记蛋白之间的波动。图1描述了蛋白-蛋白相互作用的预期实验结果。

在100%供体标记蛋白存在的条件下,没有FRET信号,因为比例转移到更大的受体,FRET信号增加,直到最大FRET获得。最大FRET将表示相互作用的化学计量。不断变化的比例,更大的受体将与焦虑减少,直到零焦虑再次看到100%受体标记蛋白。


材料与方法

  • 黑色384孔微孔板(康宁)
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH CLARIOstar
  • 完整的试剂清单和操作步骤请参考Mattiroli等人。1

实验的程序
每种蛋白分别配制1 μM浓度的原液,包括已标记的和未标记的。进一步稀释这些库存,使稀释后的库存浓度为井内反应所需浓度的两倍。最后的井反应是由20µl每种适当稀释的储备蛋白1和2创建。这可以根据图2中描述的方案来完成。

仪器的设置
由于所进行的测试具有多色性,因此,适当地设置每个色的增益是一个重要的考虑因素。为了测量受体的荧光增益,我们使用了最高的受体染料和没有供体的样品,例如P3。同样,供体荧光测量的增益设置在最高供体染料和没有受体染料的井,如D1井。首先读取FRET测量板,找到最大FRET信号的井。这个井是用来进行增益调整的。

光学设置 荧光、multichromatic端点
半音阶1:Alexa 488预设
LVF交货 488 - 14
二向色性 汽车:507.5
LVF Em 535 - 30
第2色:Atto 647预设
LVF交货 625 - 30
二向色性 汽车:647.5
LVF Em 680 - 40
半音阶3:Alexa 488/Atto 647烦恼
LVF交货 488 - 15
二向色性 汽车:577.8
LVF Em 680 - 40
获得 调整所述
一般设置 数量的闪光 50
沉淀时间 0.1秒

结果与讨论

作为原理证明,我们首先研究了组蛋白结合蛋白和组蛋白H3-H4之间的相互作用。在图2的布局中,组蛋白结合蛋白为蛋白1,H3-H4为蛋白2。图3显示了预期的1:1绑定交互。

图4显示了另外两种蛋白质相互作用试验的结果。正如你所看到的,其中一个相互作用也表现出1:1的化学计量,而另一个是2:1的相互作用化学计量。

结论

用于评估蛋白质-蛋白质相互作用化学计量的工作图已成功地应用于基于微孔板读取器的系统。这使得小型化既节省了蛋白质成分,又提高了吞吐量,在一个384孔板中最多可以研究4对蛋白质。

参考文献

1.Mattiroli等。基于fret的蛋白质复合物的化学计量测量在体外。生物。Protoc。(2018) 8: e2713。DOI: 10.21769 / BioProtoc.2713


2.用连续变分法测定结合化学计量学:作业图。Enzymol方法。87年(1982年):509 - 525

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