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利用色氨酸荧光法测定异源三聚体g蛋白的活化

Robin E. Muller David P. Siderovski Adam J. Kimple 北卡罗来纳大学 07/2009
  • 异源三聚体G蛋白激活是通过Gα亚基色氨酸荧光变化来测量的
  • 这种方法适用于大多数Gαo一些小的G蛋白在switch II区域有运动
  • 替代的,非放射的方法35S-GTPγ和(γ−32P]三磷酸鸟苷测定

表的内容

介绍

gtp结合蛋白(G-proteins)是一种重要的、被广泛描述的细胞信号分子。异三聚体g蛋白由三个亚基Gα, Gβ和Gγ组成,通常与7个跨膜g蛋白偶联受体(GPCRs)结合。g α亚基结合鸟嘌呤核苷酸而Gβ和Gγ亚基形成专性异源二聚体。在不活跃状态下,GDP结合Gα亚基与Gβγ结合。激动剂激活后,受体作为鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),释放GDP,随后结合GTP。GTP的结合导致Gα的三个柔性开关区(图1暗红色和深蓝色)发生剧烈的构象变化,导致Gα-GTP与Gβγ的解离。

活化时间受GTP水解速率的控制。两个被广泛描述的附属蛋白家族通过加速GTP水解(RGS蛋白)或延缓GDP释放(GoLoco蛋白)影响Gα亚基的动力学。g蛋白信号调节因子通过稳定过渡态加速Gα亚基GTP水解;而GoLoco基序扮演着GDIs(鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂)的角色,通过在结合核苷酸的接触上添加第二个精氨酸侧链来阻止GDP的解离。


在这个应用笔记中,我们描述了使用BMG实验室的北极星德赢vwin官网客服®Omega监测位于Gα亚基开关II区域的高度保守色氨酸的固有荧光变化(图1,“SII”)。SII的构象变化减少了Trp残基在水环境中的暴露,从而导致量子收率的增加。我们可以通过在280 nm激发下测量350 nm处Gα蛋白荧光的增加来量化这一事件。在本应用笔记中,我们通过改变Gα浓度,改变分析缓冲液,以及改变激发和发射波长来优化分析方法。

材料与方法

所有实验均在环境温度下使用康宁黑色聚苯乙烯96孔板在北极星Omega读卡器上进行。Gαi1如前所述完全纯化,在分析缓冲液中稀释至1 μM(除非另有说明),并以187 μL/孔的初始体积电镀。实验分别使用280±5 nm和350±5 nm的滤光片进行激发和发射,除非另有说明。

最大化数据采集实验期间,典型的数据收集是分为三个不同的阶段——基线(-15 - 0),激活(0 - 132 s),和高原阶段(132 - 158年),数据收集1 0.6和2 s间隔为基线,激活和高原阶段,分别使用快速动力学(模式)函数在ω。0 s下0.5 M NaF和1.2 mM AlCl分别为8 μL和5 μL3.按顺序注入,延时5秒。氟化钠和AlCl3.发生化学反应形成AlF4¯,它模拟了GTP水解时的离开磷酸基。这个稳定的络合物,Gαi1·国内生产总值·AlF4模拟Gα的活跃gtp绑定状态i1。相对于200 μL预激活的Gα,增益设置为50%i1·国内生产总值·AlF4避免信号饱和。前面描述的GoLoco基序GDI肽,AGS3Con,被使用并显示抑制Gα的形成i1·国内生产总值·AlF4¯


缓冲区
磷酸缓冲液(ph8.0) - 100 mM NaCl, 100 μM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 μM GDP, 20 mM K2HPO4/ KH2阿宝4pH值8.0


HEPES实验缓冲液(pH 8.0) - 100 mM NaCl, 100 μM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 μM GDP, 20 mM HEPES


Tris检测缓冲液(pH 8.0) - 100 mM NaCl, 100 μM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 μM GDP, 20 mM Tris


仪器的设置

荧光强度-井模式
除了以下设置,保持默认设置:
不。动能窗口的3

基线
不。间隔时间- 15,不。闪光次数- 10次,间隔时间- 1秒


激活
不。音程- 220,编号闪光次数- 10次,间隔时间- 0.6秒


高原
不。间隔- 13,不。闪光次数- 10次,间隔时间- 2秒

注射-使用320 μL/s,并保持智能注射不受限制

泵1在起始时间15 s注入8 μL(图中t=0时)
泵2在开始时间20 s注射5 μL(图中t =5s)

结果与讨论

为了测定样品浓度对最大反应的影响,我们对Gα进行了连续稀释i1在Tris ph8.0缓冲液中,从3 μM到50 nM。在Gα浓度最高时反应最强烈i1测试(图2,红色),但荧光变化可以在所有浓度下检测到。为了比较每个浓度的信号质量,计算了每个浓度的Z’因子。

这个计算说明了激励时信号变化的幅度(μ)高原- - - - - -μ基线),以及平台期收集数据的标准差(σ高原)和基准阶段(σ基线)。利用Z′因子,3 μM的Gαi1与1 μM Gα相比没有优势i1(即Z’-因子>均为0.9),而在浓度低于1 μM时,数据质量下降(未显示)。

为了评估缓冲液成分对信号强度的影响,我们测量了1 μM Gα的激活i1用各种常用缓冲盐制备的实验缓冲液(图3a)。由Z’-因子决定的测量质量与所有缓冲液相似(图3b),尽管Tris缓冲液观察到最大信号,HEPES缓冲液观察到最低信号量。

为了验证该方法可以检测Gα的激活速率,并对这个速率的变化敏感,我们培养了500 nM的Gαi1与5 μM AGS3Con肽,一个先前描述的GDI。正如预期的那样,AGS3Con的加入(图4)显著抑制了Gα的最大响应i1与500 nM Gα比较i1一个人。

结论

在本应用说明中,我们描述了一个用于测量g蛋白a亚基活性的鲁棒自动检测系统。该检测方法是一种敏感和高质量的手段,无需使用放射性标记核苷酸来测量g蛋白激活。


使用带有车载喷射器的POLARstar Omega 96孔平板阅读器进行分析,提供了对多个Gα突变体或多个自发GDP释放调节器进行三次自动化分析的优势。

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