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紫外吸收DNA定量

法兰卡甘克 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 从0.1至100μg/ ml DNA的高线性度
  • 火星评估软件提供了dsDNA, ssDNA和RNA的综合消光系数
  • 测量一个完整的吸收光谱在不到1秒每孔

表的内容

介绍

由于核酸在该UV波长下具有吸收最大值,核酸检测最常见的核酸检测方法之一是在260nm(a260)下测量溶液吸光度。

A260虽然是一种相对简单和历史悠久的方法,但灵敏度低,受到核苷酸和单链核酸的干扰。此外,通常用于核酸制备的化合物在260nm处吸收,导致定量水平异常高。然而,这些干扰和制备化合物也在280nm处吸收,从而通过在A260/ A280处进行比值吸光度测量来计算DNA纯度。

因此,在这两个吸光波长之间构建吸光比可以提供样品纯度的估计。一般来说,任何A260/A280大于约1.7的制剂都称为“纯”。

比较分光光度计和酶标仪的结果
吸光度的测定受比尔定律的支配。

公元前一个=ε

如果A吸收,ε是摩尔消光系数,B是路径长度,C是分析物浓度。当摩尔系数和路径长度恒定时,吸光度与浓度成比例。

对于标准试管阅读器,路径长度通常定义为1厘米。因此,在常规的吸光度读数为1.0 OD的A260对应50 μg/ml的dsDNA溶液。在微孔板读取器中,由于微孔的路径长度较小,同样的DNA浓度测量的OD值较小(约0.7 OD)。BMG仪器中的集成光谱仪提供了路径长度校正功能,允许快速测定样品中的DNA浓度,以及与基于试管的测量结果相媲美的结果。

比吸光度法定量DNA的另一种方法是荧光技术,它对DNA更加敏感和特异。的Quant-iT PicoGreen®来自Life Technologies的dsDNA定量试剂®例如,一种高灵敏度的双链DNA (dsDNA)荧光检测方法。


材料与方法

通过来自制造商的正态分布通道获得所有材料。

  • 紫外线星板,96格莱纳一号生物
  • 脱氧核糖核酸,小牛胸腺活化,冻干粉,Sigma-Aldrich
  • 蒸馏水
  • 基于光谱仪的BMG LABTECH微板德赢vwin官网客服阅读器

此外,根据各种制造商根据需要使用诸如移液管和微量离心管的耗材。将来自CALF胸腺量的DNA在蒸馏水中溶解至终浓度为1mg / mL。从该储备溶液中,进行进一步的稀释液,得到不同的DNA标准,范围为0.1至100μg/ mL。将350μl等分试样的每种标准物的四个重复移液到96孔UV板中。另外,将350μL等分试样的蒸馏水的16重复移液到板中以用作坯料。将制备的96孔板插入仪器中,使用以下设置测量UV吸光度。

仪器的设置

Spectrastar nano. FLUOstar / POLARstarω www.v66088.com PHERAstar FS
检测
模式
吸光度
谱仪
设置
选择波长:260和280nm或
测量220到400纳米之间的光谱
预定义的
协议

测量有两种可能。您可以选择多达8个特定波长(在这种情况下波长为260 nm和280 nm),或者您可以测量样品的光谱。图1给出了使用不同浓度DNA进行DNA光谱扫描的示例。

结果与讨论

从测量的数据被评估使用火星数据分析软件BMG L德赢vwin官网客服ABTECH。从每个浓度的测量值中减去空白测量值的平均值,并绘制出结果。对标准值进行线性回归拟合(图2)。

标准曲线可用于未知样本的反计算。灵敏度< 0.3 μg/mL DNA(或约0.1 μg DNA/孔),选定260 nm波长和光谱测量。

新火星数据分析软件中的进一步选择是在没有标准曲线的情况下确定未知样品的DNA浓度。基于50μg双链DNA的知识显示出1.0的OD值,自动计算浓度而不需要将标准移液到微孔板中。应该考虑到该方法在激活路径长度校正功能时,此方法仅适用于。

由于双链和单链DNA或RNA有不同的消光系数,这些不同的核酸有不同的火星模板(表1)。

表1:不同核酸消光系数。

核酸 灭绝系数
(cm - 1·m - 1)
火星的数据
分析软件
双链DNA 50. dsDNA模板
单链DNA 33. ssDNA模板
核糖核酸 40. RNA模板

结论

由于其光谱仪,BMG LABTECH仪器提供易于处理的DN德赢vwin官网客服A吸光度测量,只需选择260 nm的波长或测量覆盖最大吸光度的光谱。此外,在数据分析软件MARS的帮助下,可以根据消光系数确定不同的核酸浓度。

A260/A280的比值表明了DNA样品的纯度,它可以像单独A260一样简单且在相同的时间内测量。在220-1000 nm范围内的全吸收光谱有助于识别杂质,每孔可在1秒内测量。

PicoGreen是Invitrogen公司的注册商标。

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